Ученые bet356体育在线 синтезировали новые реагенты для присоединения флуоресцентных красителей к молекулам живых клеток

Химики и биологи Санкт-Петербургского университета разработали новые реагенты на основе гетероциклоалкинов, которые позволят надежно и безопасно присоединять флуоресцентные метки к биомолекулам. Созданные вещества помогут визуализировать процессы, протекающие в клетках и тканях живых организмов, и изучать их динамику в режиме реального времени.

Применение циклононина, содержащего зеленую флуоресцентную метку, для модификации и визуализации при помощи флуоресцентной микроскопии азидогликанов (А) и азидо-ДНК (B) раковых клеток HEK293
Применение циклононина, содержащего зеленую флуоресцентную метку, для модификации и визуализации при помощи флуоресцентной микроскопии азидогликанов (А) и азидо-ДНК (B) раковых клеток HEK293

Результаты работы опубликованы в Journal of the American Chemical Society.

Современные ученые могут исследовать состав и изменение живых клеток с помощью флуоресцентного биоимиджинга. Это метод, при котором интересующие исследователя молекулы организма, например белки или ДНК, ?подсвечиваются? флуоресцентными красителями и под воздействием света определенной длины волны становятся видимыми для скрининговых систем.

Чтобы биоимиджинг был успешным, необходимо надежно ?сшить? флуоресцентные метки и выбранные молекулы. Для этого используют специальные химические реакции. По словам кандидата химических наук доцента кафедры органической химии bet356体育在线 Натальи Данилкиной, самыми востребованными и сбалансированными сегодня являются реакции SPAAC (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition). Они позволяют непосредственно в клетках присоединять к биополимерным молекулам, модифицированным азидными группами, специальные реагенты — циклоалкины, содержащие метку с красителем.

SPAAC — это биортогональная клик-реакция, то есть реакция, которая способна протекать в живых клетках, но при этом не вредит им и сама не подвержена влиянию со стороны живых систем.

Кандидат химических наук доцент кафедры органической химии bet356体育在线 Наталья Данилкина

?В таких реакциях не требуется использовать токсичные медные катализаторы, в них отсутствуют побочные продукты. Реакции SPAAC чрезвычайно важны для того, чтобы проводить биологические эксперименты. Таким образом можно изучать физиологию живых клеток и процессы, которые в них протекают, а также устанавливать склонность клеток к преобразованию в опухолевые?, — объясняет исследователь.

Реакция SPAAC как ключевой метод биоортогональной химии
Реакция SPAAC как ключевой метод биоортогональной химии

Как отмечает Наталья Данилкина, на рынке уже существует несколько видов реагентов на основе циклоалкинов — молекул, имеющих замкнутый цикл из атомов углерода с тройной углерод-углеродной связью внутри цикла. Однако ученым bet356体育在线 под руководством доктора химических наук директора Института химии Ирины Баловой удалось синтезировать принципиально новые реагенты. Они отличаются легкодоступностью и оптимальным балансом между реакционной способностью в SPAAC и стабильностью, то есть устойчивостью к окружающей среде и прочим реагентам.

Работа над веществами проходила в несколько этапов. Вначале исследователи создали специальный синтетический метод для получения циклоалкинов. Он позволил легко сконструировать и синтезировать серию молекул с разным размером цикла (от восьми до десяти атомов) и специальными структурными элементами — гетероциклическим кольцом и гетероатомом (любым атомом, кроме углерода или водорода) в циклоалкине. Эти элементы были важны для регулировки баланса между активностью в SPAAC и стабильностью.

Следом химики bet356体育在线 изучили реакционную способность и устойчивость синтезированных соединений с помощью кинетических исследований и квантовых химических расчетов. Работы проводились на базе Научного парка bet356体育在线: в Вычислительном центре, а также в ресурсных центрах ?Методы анализа состава вещества?, ?Магнитно-резонансные методы исследования? и ?Рентгенодифракционные методы исследования?.

По словам Натальи Данилкиной, эксперименты и расчеты помогли выявить неклассическую реакционную способность соединений с циклами из девяти атомов.

Обычно чем больше цикл, тем меньше реакционная способность и больше стабильность соединений. В нашем случае стабильность действительно отличалась: с восьмичленными циклами было невозможно работать из-за их неустойчивости, а девятичленные оказались стабильными.

Кандидат химических наук доцент кафедры органической химии bet356体育在线 Наталья Данилкина

?А вот реакционная способность восьмичленных и девятичленных циклов при этом была практически одинаковой?, — поясняет исследовательница.

На основе этих данных ученые bet356体育在线 установили, что гетероцикл-содержащие гетероциклоалкины из девяти атомов (циклононины) — самая подходящая группа реагентов для SPAAC. Как рассказала Наталья Данилкина, у этих соединений наблюдается наилучший баланс между стабильностью и реакционной способностью. Тогда как соединения с циклами из восьми атомов (циклооктины) оказались слишком нестабильными, а вещества из десяти атомов (циклодецины) инертными.

Схема, иллюстрирующая различие в стабильности и реакционной способности новых циклоалкинов
Схема, иллюстрирующая различие в стабильности и реакционной способности новых циклоалкинов

На последнем этапе исследователи bet356体育在线 разработали метод присоединения флуоресцентных красителей к новой группе реагентов и провели эксперименты по введению получившихся соединений в биомолекулы раковых клеток. Исследования проходили в лаборатории биомедицинской химии bet356体育在线. Эксперименты подтвердили эффективность циклоалкинов с девятичленным циклом для SPAAC. Как сообщила Наталья Данилкина, ученые bet356体育在线 уже могут использовать новые реагенты для проведения исследований по различным направлениям.

В настоящее время научная группа работает над усовершенствованием полученных веществ. ?Сейчас для того, чтобы в клетке прошла реакция с использованием наших реагентов, требуется восемь часов. Мы стремимся довести эту реакционную способность до 15 минут. Проверяем все возможные варианты структур с улучшенной реакционной способностью при сохранении стабильности. Ищем наиболее эффективную молекулу. Также подбираем оптимальные пути связывания реагентов с флуоресцентными красителями и другими группами?, — заключает Наталья Данилкина. Она добавляет, что в дальнейшем исследователи планируют запатентовать разработку.

Наша работа полностью отвечает приоритетным направлениям Программы научно-технологического развития Российской Федерации и Программы развития bet356体育在线, которые связаны с переходом к персонализированной медицине и высокотехнологичному здравоохранению.

Руководитель исследовательской группы, директор Института химии bet356体育在线 доктор химических наук, профессор Ирина Балова

?Молекулы, которые мы придумываем и синтезируем, являются молекулярными инструментами для биологов и медиков. Они позволяют им исследовать молекулярные механизмы заболеваний и находить эффективные методы их лечения?, — отметила руководитель исследовательской группы, директор Института химии bet356体育在线 доктор химических наук, профессор Ирина Балова.

Исследование было поддержано грантом РФФИ № 20-03-00117 и грантами РНФ 21-13-00218, 19-73-10077.